【前沿科研】SCIENION点样技术成功应用于EVONETIX DNA合成平台-技术前沿-资讯-生物在线

【前沿科研】SCIENION点样技术成功应用于EVONETIX DNA合成平台

作者:Scienion 2024-05-27T00:00 (访问量:28079)

SCIENION* EVONETIX
利用 SCIENION 的精密点样技术对 EVONETIX 用于 DNA 合成的半导体芯片进行表面功能化处理
 
摘要

在这项研究中,Evonetix公司和 Scienion公司合作开发了一种在硅半导体芯片上进行高度并进行DNA 合成的可扩展工艺。利用 Scienon 的精密点样技术,在 Evonetix的 DNA合成平台上点样了一个启动DNA合成的链接物 ,直径为100微米的金点。研究结果表明,链接物可以精确地放置在反应点上,从而最大限度地减少溢出,并最大限度地减少相邻 DNA 序列之间的串扰。Evonetix 在 DNA 合成研究中成功证明了涂层芯片的功能。

 
Evonetix

Evonetix公司是一家总部位于剑桥的公司,致力于开发新型半导体技术,以大规模生成高保真度的DNA。

这款桌面DNA合成平台提供了前所未有的精确度、规模和速度进行DNA合成的能力。

DNA合成在半导体芯片上实现的独立温控反应点位上进行(图 1)。

在反应位点上沉积一层薄薄的金属层,下一步将使用内部开发的基底涂层对其进行功能化处理。

该涂层可实现与金属点的共价结合,随后固定连接体。连接体带有一个活性头基的分子,用于结合第一个磷酰胺酸二酯,启动单链DNA合成。芯片本身被组装到一块印刷电路板中。芯片顶部有一个流体室。

图1:打印电路板(左)上装有独立温控反应点(右)的组装半导体芯片。

 
SCIENION

Scienion GmbH 是一家提供完整解决方案的公司,

专注于开发和制造用于诊断和其他生命科学领域的微型化多重检测。

Scienion 公司的核心技术基于皮升和纳升范围内的非接触点样,起点为 10 pL/滴。除了仪器和耗材,Scienion 还提供一系列定制开发和制造服务。在本应用说明中,我们进行了原理验证 (POP) 研究,以了解 Evonetix 半导体芯片上的点样工艺技术。

最后,Scienion的点样技术成功应用于功能化Evonetix的DNA合成平台。

因此,在已预先预涂的100微米大的金反应位点上分配了一个连接物,以启动半导体芯片上的DNA合成。

图2(左)本研究中使用的集成了sciDROP PICO 技术的 sciFLEXARRAYER SX 精密点样仪。(右图)sciFLEXARRAYER SX 的点样装置放大图。

包括:(1)压电点样毛细管;(2)点样后用于对目标成像的垂直摄像头;(3)用于可视化和量化滴液参数的高分辨率摄像头。 

结果与讨论

初步研究

首先,利用 Scienion 的定制开发服务,进行了一项初步研究,以了解芯片表面、滴液量和斑点直径之间的相互作用。

表面润湿性对光斑直径的影响

为了估算覆盖 Evonetix 芯片上 100 µm 直径金反应位点所需的滴液体积,使用 Scienion 的精密点样技术将不同体积(80 - 320 pL)的水滴点样到不同的目标上。通过垂直摄像头拍摄沉积的滴液(斑点)的照片,并通过 sciFLEX 软件分析它们的直径。此外,还对相关支撑材料进行了水接触角测量,以分析它们的润湿性质。最后,还评估了润湿性质对斑点直径的影响。

作为研究的主要支持物,使用未涂层的金基片(CA:96°)和基底涂层金基片(CA:95°)来模拟金位点。这两种载玻片均由 Evonetix 公司提供。为了进行比较,另外使用了sciCHIP H2(CA:106°)和sciCHIP Epoxy(CA:53°)载玻片作为额外的参考表面。

图 3:sciCHIP H2、sciCHIP Epoxy 涂层金片和基底涂层金芯片的液滴斑点直径(y 轴)与喷点量(x 轴)的关系。

不同缓冲条件对斑点形成(斑点大小)的影响

Evonetix的半导体芯片上直径100 µm的反应位点需要覆盖DNA连接剂。我们研究了三种缓冲液中哪种最适合将 DNA 连接固定在预涂覆的金位点上。此外,将滴液量在200 pL和3200 pL之间变化,以评估最佳分配体积。检测在涂有金的载玻片上进行,以研究缓冲液组成和滴液量对斑点形成的影响。

以 200 pL/滴/轮的顺序分配 200 - 3200 pL/斑点,轮次之间等待时间为2分钟。每个序列后测量斑点直径(图4)。使用了Evonetix提供的Evx缓冲液和Scienion提供的sciSPOT B2作为缓冲试剂。此外,Evx缓冲液与sciSPOT B2混合,结合了两种缓冲液的特性。

图 4:在涂层金片上依次喷点Evx缓冲液、sciSPOT B2缓冲液及它们的混合物后获得的斑点直径(每轮200 pL)。

使用Evx 缓冲液时,分配200 pL 时,光斑直径为 98 ± 2 µm,分配 400 pL 时,光斑直径为 127 ± 3 µm。沉积 800 pL 后,每多沉积一轮,光斑直径增加不到 10%。使用sciSPOT B2 缓冲液时,200 pL 的直径为 102 ± 2 µm,400 pL 的直径为 115 ± 5 µm。每增加一轮点样,光斑直径几乎线性增加 5-13%。使用Evx 缓冲液 + sciSPOT B2 缓冲液时,200 pL 的光斑直径为 79 ± 3 µm,400 pL 的光斑直径为 110 ± 2 µm。

在 200 - 800 pL(增加 40-47%)和 800 - 3200 pL(增加 4-13%)之间,光斑直径几乎呈线性增长(增加 4-13%)。

覆盖 100 µm 图层金表面所需的体积约为 200 pL。所有测试的三种缓冲液都能覆盖目标的光斑直径。我们决定使用Evx 缓冲液 + sciSPOT B2 缓冲液 的组合特性来沉积 DNA 连接体,以达到最佳固定效果。

利用 Scienion 的精密点样技术实现 Evonetix 芯片的功能化

Evonetix的芯片具有独立温度控制的反应位点,在Scienion处进行了基底涂层的功能化处理。芯片被组装到芯片载体中,连接到流体夹具上,进行清洗,并根据Evonetix提供的方案进行反应性和热稳定性涂层的功能化处理。在接下来的步骤中,带有芯片的载体被放置在sciFLEXARRAYER SX的靶板上(见图5)。靶板冷却至8°C,相对湿度设定为65%。

图 5:四个装有涂层芯片的 Kinabalu 芯片载体被放置在 sciFLEXARRAYER SX 的目标平台上。

作为试剂,ssDNA-Cy5 和一个连接物被打印在反应位点上。第一种试剂用作阳性对照,而第二种试剂可在随后的合成过程中固定第一个 DNA 碱基。大约需要200pL试剂才能覆盖直径为100µm 的反应位点,确保不会溢出到相邻区域(图6),这验证了在不同缓冲液条件下的初步研究结果。

(a)201pL/drop of linker in phosphate buffer 

201 pL/滴磷酸盐缓冲液中的连接体。

(b) 204 pL/drop of ssDNA-Cy5 in Evx buffer +sciSPOT B2 mix204 pL/滴ssDNA-Cy5,Evx 缓冲溶液 +sciSPOT B2 混合液。

图6:通过 sciFLEXARRAYER SX的水平摄像头拍摄的200 pL水平图像。

芯片上的反应位点按三个区域排列,每个区域有3x3个反应点。

每个区域内的反应点之间的间距为400微米(双向),区域之间的间距为2800微米。

在点样过程中,每个区域的 3/3 位点留空,ssDNA-Cy5 沉积在 2/2 位点(中心点)。

连接物被沉积在其余位点上(图7)。

图7:阵列布局:空位图像(3/3 位置)、阳性对照 ssDNA(2/2 位置)和连接物(其余位置)沉积在涂金反应位点上。

试剂按两轮顺序预埋:先喷 200 pL 试剂,5 分钟后再在每个部位沉积 200pL相同的试剂,以增加试剂的累积量。最终的平均光斑直径为 120 µm ± 10 µm,这表明溢出极少。沉积完成后,芯片在相对湿度为 70% 的室温下培养过夜。剩余的试剂通过清洗程序从表面清除。

ssDNA被合成在所有连接功能化的金位点上(阳性对照的2/2位和空位3/3除外),并与 ROX 标记的互补 ssDNA 杂交。使用 Leica DMi8 荧光显微镜观察 ROX 标记的 ssDNA 的荧光图像表明,在先前连接功能化的反应位点上成功合成了目标 ssDNA(图 8a)。测得的荧光强度为 5715 ± 395 RFU,是 3/3 位置未功能化反应位点(1130 ± 90 RFU)的 5 倍。阳性对照ssDNA-Cy5在2/2位置的荧光强度比未涂层的反应位点高出9倍(阳性位点:17117 ± 4248 RFU;未涂点的对照位点:1911 ± 87 RFU)。

图 8:使用 Leica DMi8 荧光显微镜在同一芯片上拍摄的荧光图像(a)ROX 标记的辅助 ssDNA 与合成在连接器功能化位点上的ssDNA杂交后的图像(LED 激发 560 纳米,发射滤光片 592-668 纳米,5 倍放大镜)

b)阳性对照的荧光图像(LED 激发 635 纳米,发射滤光片 666-724 纳米,5 倍放大镜)。

随后的研究中,我们在金位点上沉积了3滴连接剂,

以研究固定连接剂的密度如何影响ssDNA的合成量:2滴、6滴和 8滴(每滴 200 pl)。

与ROX标记的互补ssDNA杂交后,拍摄荧光图像(Leica DMi8荧光显微镜)并测量荧光强度(图 9)。

可以得出的结论是,随着固定的连接剂的增加,荧光强度也随之增加,合成的ssDNA量也随之增加。

6滴/点的沉积导致荧光强度:

- 与沉积2滴连接剂后的荧光强度相比几乎高出3倍

- 与沉积8滴/点连接剂后获得的荧光强度相比处于同一数量级。

结论

Scienion的精密点样技术成功应用于Evonetix开发的DNA合成平台的100微米大金位点的功能化。

我们对不同的点样参数(包括缓冲液和连接剂浓度)进行了评估,以确定DNA合成的最佳参数。

我们能够证明,在同一反应位点上点样 2-3 滴(200 pL)连接剂会导致信号增加。点样六滴足以使点样区域的反应位点达到饱和,超过饱和后,信号不再增加。 

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