spheroONE与GrowDex®携手,开启3D细胞培养新篇章-技术前沿-资讯-生物在线

spheroONE与GrowDex®携手,开启3D细胞培养新篇章

作者:Scienion 2024-05-27T00:00 (访问量:28017)

CELLENION* UPM
将GrowDex®和spheroONE结合以实现自动化和高度可重复的3D细胞培养工作流程
# 摘要

本应用说明展示了spheroONE和GrowDex®的兼容性,用于自动化3D细胞培养工作流程。spheroONE是一款纳升级细胞分选仪,可以分选和分离球形细胞和器官组织。GrowDex® 是一种植物提取的纳米纤维素 (NFC) 水凝胶,为培养各种类型的细胞提供有效的3D基质。在这项工作中,研究人员证明,在这种纳米纤维素基质中播种的单个 HepG2 细胞可以无缝地培育出大量 HepG2 球形样本。随后,spheroONE可用于自动分配GrowDex®到微孔板中,以便对单个HepG2球体进行分选、分离和嵌入,为后续的筛选应用准备高度可重复的检测就绪微孔板。

# 介绍

近年来,人们对3D模型的兴趣激增,这是因为它们与传统的2D模型相比更具有生理学的相关性。这些3D模型表现出独特的特征,如空间结构、扩散阻隔、独特的基因表达模式和耐药性。它们已成为再生医学研究和抗肿瘤药物筛选的首选。我们的研究提供了一个专门针对HepG2球体的解决方案。该模型应用广泛,包括肝病建模(非酒精性脂肪肝、肝癌、病毒性肝炎)、肝毒性评估以及了解药物在生理环境下对肝细胞的影响。HepG2 球形细胞还有助于肝脏代谢、酶活性和基因表达分析,揭示各种肝脏相关疾病的复杂分子机制。确保使用3D模型进行可重复的高通量筛选取决于基于大小和形态选择高度均匀的球体群体。这种均匀性是可靠和可重复实验的基础,需要适当的培养基质来保证球形体的持续生长和活力,从而实现长期筛选。为此,我们推出了一种将先进的spheroONE技术与GrowDex®的优质特性相结合的解决方案。

SpheroONE是一种创新型仪器,专为分离和分选球形体、肿瘤细胞和器官组织等大颗粒而设计。它的自动化功能简化了工作流程并提高了效率。此外,它还能精确分配缓冲液和培养基,是一种适用于多种应用的多功能工具。

另一方面,GrowDex® 水凝胶是不含动物成分的植物提取纳米纤维素 (NFC) 水凝胶,可为培养各种类型的细胞提供有效的3D基质。GrowDex 类似于人体的细胞外基质,支持细胞生长,并使分子易于扩散。GrowDex® 与自动化兼容,不需要特殊的处理和储存条件,易于操作,因此非常适合各种基于3D细胞的筛选应用。先进的SpheroONE技术与成熟的GrowDex®之间的共生协同效应在3D细胞培养和筛选领域树立了新的标准,为研究人员提供了一个强大而多功能工具,以促进他们的研究并加速科学发现。

# 方法与结果

A.在GrowDex® 中形成HepG2球形细胞:

HepG2细胞在完整培养基中传统单层培养4天。通过将GrowDex®原液(1.5% w/v)与完整培养基稀释,制备GrowDex® 工作溶液(0.5% w/v)。收获 HepG2 细胞,并以 10^5 cells/mL 的浓度将其重新悬浮在GrowDex® 工作溶液

(0.5%w/v)中。将悬浮在GrowDex®中的细胞移液至96孔底平底ULA板的每个孔中(100 µL/孔),结果每孔约有 10,000 个细胞。随后,用移液管将完全培养基移入每个孔(100 µL/孔),置于细胞负载的 GrowDex® 层之上(图 1)。最后,将微孔板置于标准细胞培养条件下(37°C,5%CO2)培养 5 天,得到 HepG2 球形细胞。

1. GrowDex®中高通量形成HepG2球体的过程。

a. HepG2 细胞的2D培养。 b. 收获细胞并将其重新悬浮在用培养基稀释的 GrowDex® 中。c.  100µL HepG2 细胞培养在 GrowDex® 中的每个孔中并加入100µL细胞培养基。d. 培养 5 天后在 GrowDex® 中形成 HepG2 球形细胞。

培养5天后,每孔产生约1400个HepG2 小球。显微镜成像显示了直径约为50至130微米的异质球体群。

B.使用spheroONE进行GrowDex®配液:spheroONE能够自动分配各种溶液和试剂(粘度高达22.5 mPa*s,如70%甘油溶液)。spheroONE 由一个加压储液器、一个电磁阀和一个小孔径喷嘴组成,可实现高精度的纳升级按需滴加。通过控制滴液体积和点滴次数,它为微孔板的每个孔提供了一种通用解决方案,可重复地填充纳升至微升级别的溶液体积。

在这项研究中,SpheroONE 成功地将 GrowDex® 0.5% w/v 自动分配到 384 ULA 板(15 µL/孔)中。使用 600 µm纳米喷点毛细管(NDC 600)喷点水凝胶,阀门参数如下:压力为 mBar,启动时间为 1500 ms。使用SpheroONE进行自动孔预填充大大方便了微孔板制备,并显著减少了气泡的形成,而气泡的形成通常会阻碍手动移液的微孔板制备。

C.使用spheroONE分离HepG2球形颗粒:

借助spheroONE的光学系统(包括高分辨率摄像头、暗场照明模块)和玻璃 NDC,它能够检测、分析、排序和分离直径在50至600范围内的颗粒。当颗粒沉降减少时,使用spheroONE进行颗粒的分离和回收效果大大提高。在这项研究中,将球状体在GrowDex®中重新悬浮,显著减轻了颗粒的沉降,从而大大提高了回收和分离效率。

在球形体分离当天,将GrowDex® 中的100µL 球形体培养物(在 A 部分中制备)重悬于2mLPBS 中,以获得GrowDex® 0.025%w/v中约700个球状体/mL的最终浓度。随后将该样品放入spheroONE的储液器中,并与预填充的384 ULA 板(在 B 部分中制备)一起安装在spheroONE内。

spheroONE安装了NDC 300(直径 300 μm),并设置了以下阀门参数:压力为200mBar,启动时间为 10 ms。检测和分离参数设置如下表1所示。

表1. 用于在0.025%w/v GrowDex®中分离HepG2类囊体的spheroONE检测和隔离参数: 

图2. 使用spheroONE 对HepG2 球体进行排序和隔离。

a. 暗视野图像展示一个球体(直径99 微米,长径比:1.68)。b. 显微镜图像展示在384 ULA 板孔内分离的一个球体。c. 散点图表示实验期间检测到的球体,绿色表示分离的球体,黄色表示由于NDC 中存在多个颗粒而未分离的球体,粉色表示不符合分离标准的球体。

在 384 ULA 板的每个孔中,单个 HepG2 球形体被成功分离到预填充的 GrowDex® 层上(图 2)。然后使用spheroONE进行另外两个试剂分配步骤:每个孔中再加入 15 µl 0.5% w/v 的 GrowDex® 以完全包埋球形体;最后,在包埋的 HepG2 球形体上分配 25µl 完全培养基,以获得可用于进一步培养和/或筛选的平板。

研究结论

这项研究成功证明了 GrowDex® 和 spheroONE 在3D细胞培养实验微孔板制备自动化和标准化方面的协同作用。第一步展示了使用 GrowDex® 在单个 96 孔 ULA 板中高通量形成 10 万多个 HepG2 球形细胞的优势。在第二步中,SpheroONE 被用作试剂分配器,在 384 孔 ULA 板的每个孔中预先填充一层 GrowDex®。随后,用SpheroONE装入HepG2球形体, 然后在384孔ULA板内对单个球体进行排序和分离。最后,用 spheroONE 再分装一层 GrowDex®,将每个小球完全包埋,并在顶部加入培养基(图3),以获得可用于进一步实验或筛选应用的微孔板。

这一工作流程的主要优势在于其简化的自动化操作,通过使用spheroONE既能将规定体积的 GrowDex®(和试剂)精确分配到预定义的目标平板中,又能高精度地排序和分离单个球体。

这种创新方法展示了在 GrowDex® 中高效率和高通量准备球体的成本效益,然后在准备好的实验板中自动准备具有单个球体的统一孔位,这将对高度可重复的3D细胞培养实验产生重要影响。

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