亲和层析的特异、灵敏性及快速高效等特点，使其在生物制药、生物化学、分子生物学、临床诊断等多个领域都有重要应用。然而市售成熟的相关介质并非完全能够匹配所研项目需求，因此自制亲和填料成为理想工具之一。

预活化层析填料可以偶联一个特定的配基，制备成一个可以纯化一种或者几种目标分子的亲和填料。例如，可以使用抗体、抗原、酶、受体、小的核酸或者多肽作为配基，纯化能与它们结合的相应的配体。

相关填料介绍

偶联方案

• 偶联溶液A：1mM HCl 

• 偶联溶液B：0.1M NaHCO3、0.5M NaCl，pH 8.3

◉ 填料换液处理

取已知体积介质于砂芯漏斗中，用预冷的偶联溶液 A（0~4℃）洗涤，至少洗 30min，1ml 介质用约 20ml 的偶联溶液 A 洗涤；注意：NHS 对应配基在 pH 较高时会迅速水解。

◉ 配基换液及偶联反应

配基用偶联溶液 B 溶解，或用 Bestdex G-25 层析柱置换于偶联溶液 B 中（配基偶联浓度 5~10mg/ml 填料）。将洗好的介质用偶联溶液 A 稀释（1ml 介质约 0.5ml 偶联溶液 A），并与配基溶液等体积混合，室温混匀 4h 或 4℃ 搅拌过夜（不能使用磁力搅拌器）。

• 说明：在室温下，偶联过程通常非常快，因此，通过优化偶联时间来维持配基的生物活性是很重要的 (先准备配基再进行填料的换液处理)。

◉ 封闭和清洗

• 封闭：抽去偶联上清并加入封闭液（0.1M Tris-HCl，pH 8.5），室温封闭 2~4h；

• 清洗： 0.1M Tris-HCl+0.5M NaCl， pH 8~9 与 0.1M 醋酸盐缓冲液+0.5M NaCl，pH 3~4 交替洗涤 3~6 次，每次用 3 倍凝胶体积的液体洗涤；

• 用 PBS 清洗后使用或保存于 20% 乙醇中（配基必须在 20% 乙醇中稳定）。

层析案例分享

◉ CNBr-activated Bestarose 4B

抗原作为配基实现多克隆抗血清的高通量纯化该案例是将特定的抗原偶联到预活化的填料上，制备成专用的亲和层析柱，从多克隆抗血清中纯化特异性的抗体。

◉ NHS-activated Bestarose 4FF 偶联多肽捕获重组蛋白

注意事项

一般情况下，当配基分子量＜5KDa时使用间隔臂，而对于大分子，间隔臂非必须。例如，NHS 预活化填料的反应位点与填料基架之间有 10 个原子的间隔臂，而 CNBr 则没有，对于小分子配基（＜5KDa），当配基和样品结合的时候，由于 CNBr 没有间隔臂，可能会由于空间位阻而影响结合，在这种情况下，建议使用 NHS 活化配基填料。对于大于 5KDa 的配基，二者差异不大。